作者：王鋆泉 北京市朝陽區(qū)六里屯社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(北京城建老年病醫(yī)院)

使用倒置DMI6000B顯微鏡（徠卡微系統(tǒng)）以5秒間隔記錄2 min的延時(shí)視頻，配備63X/1.4-0.6 NA平面-后彩色油浸物鏡，EMCCD數(shù)碼相機(jī)，并由變形軟件控制。為了實(shí)際上消除兩個(gè)通道采集之間的延遲，照明依次由488nm和561nm二極管聲光關(guān)閉激光器和一個(gè)針對488/561nm激光源優(yōu)化的雙帶濾光片立方體。實(shí)驗(yàn)采集期間的環(huán)境溫度平均為37°C。斐濟(jì)軟件被用于漂白校正和電影蒙太奇。利用冰成像軟件
STED成像：使用凝集素小麥胚芽凝集素（WGA）與Alexa 488 nm結(jié)合，在37°C下培養(yǎng)10 min，在活神經(jīng)元上標(biāo)記神經(jīng)元膜。神經(jīng)元用4% PFA /0,2%戊二醛混合物洗滌和固定，然后進(jìn)行免疫化學(xué)處理。生長錐用3D STED顯微鏡成像，使用775 nm脈沖耗盡激光和電動(dòng)領(lǐng)93X甘油物鏡。對內(nèi)源性E-Syt2的一抗進(jìn)行清除，用二抗偶聯(lián)Alexa 594標(biāo)記。Sec22b-pHL用一抗GFP和ATTO647N二抗標(biāo)記。采集在三維STED中進(jìn)行，使體素大小是各向同性的。通常，我們在20到25 z平面上成像一個(gè)1400x1400像素的矩陣，以包括所有的生長錐體積。生長錐使用Icy“HK意思”插件.進(jìn)行分割E-Syt2-和Sec22的空間分布分析是使用“冰SODA”插件和一個(gè)專用的LD協(xié)議自動(dòng)化完成的。簡單地說，通過Ripley函數(shù)分析了E-Syt2和Sec22b的分布。在同心目標(biāo)上評估了兩個(gè)分子之間的統(tǒng)計(jì)耦合。在4個(gè)不同的生長錐中分析了超過13784個(gè)E-Syt2簇，
20%與Sec22b有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。當(dāng)相關(guān)聯(lián)時(shí)，這兩個(gè)分子在84nm ±9nm，這與細(xì)胞科學(xué)雜志接受的34%的Secc22b簇對應(yīng)。這種耦合具有非常高的意義，因?yàn)閜值在10-5-10-24之間。使用Icy ROI包含分析插件測量到質(zhì)膜(d)的距離。PLA信號(hào)：對包括整個(gè)細(xì)胞在內(nèi)的共聚焦z-堆棧進(jìn)行最大強(qiáng)度投影，以觀察PLA斑點(diǎn)的最大數(shù)量。使用斐濟(jì)/ImageJ中的細(xì)胞計(jì)數(shù)器插件計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。在神經(jīng)元中，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞體和神經(jīng)突中的PLA斑點(diǎn)，并將PLA信號(hào)除以相應(yīng)隔室的面積。
神經(jīng)元長度。為了分析培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)突長度，我們使用斐濟(jì)/ImageJ中的NeuronJ插件對eGFP通道z堆棧的最大強(qiáng)度投影進(jìn)行圖像分析。測量每個(gè)神經(jīng)元的主要過程和分支。我們無法檢測到單個(gè)細(xì)胞之間的任何關(guān)聯(lián)，因此我們認(rèn)為每個(gè)細(xì)胞都是一個(gè)采樣單位。
尖峰面積：在Myc-E-Syt2過表達(dá)的HeLa細(xì)胞中，尖峰面積是在eGFP通道的z堆棧的最大強(qiáng)度投影上測量的。測量是通過從整個(gè)cel的ROI中減去沒有峰值的細(xì)胞的興趣區(qū)域（ROI），通過應(yīng)用斐濟(jì)/ImageJ上的工具過濾器/中位數(shù)獲得
GFP-Trap下拉和免疫印跡轉(zhuǎn)染的HeLa或PC12細(xì)胞在TBS（20mM Tris-HCl，pH7.5,150mM氯化鈉）中裂解，包含2mM EDTA，1% Triton-X100和蛋白酶抑制劑（羅氏診斷）。以16000xg15 min離心獲得澄清裂解液，1 mg蛋白在頭對頭攪拌下在4°C下GFP-Trap下拉1小時(shí)。使用實(shí)驗(yàn)室制備的瓊脂糖偶聯(lián)GFP結(jié)合蛋白的10μl，用裂解緩沖液洗滌四次后，珠粒在95°C下加熱5 min，在Laemmli樣品緩沖液中還原。可溶性材料使用10 %丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE處理，并在硝化纖維素膜上電轉(zhuǎn)移（GE-hearcth）。用2.5%（w/v）脫脂牛奶、0.1%（w/v）Tween-20PBS封閉細(xì)胞膜。，感興趣的膜區(qū)域與一抗孵育，。洗滌后，用HRP偶聯(lián)的二抗印跡細(xì)胞膜。通過使用ChemiDoc發(fā)光成象儀（BioRad）進(jìn)行了揭示。
從E18胚胎中提取大鼠皮質(zhì)的共免疫沉淀在0-2°C在20毫米Tris：鹽酸pH 7.4,150毫米氯化鈉，4毫米EDTA，2毫米氯化鎂和蛋白酶抑制劑（羅氏診斷），然后加入2%（w/v，最終濃度）TritonX-100后裂解30 min。在14000xg離心12 min后，在透明裂解液中檢測min蛋白。通常，250毫克的組織在?11mg/ml下產(chǎn)生1.3毫升的提取物。5毫克總蛋白（0.6 ml）與5μg蛋白g結(jié)合兔抗合成蛋白-3抗體（克隆TG0）或5μg幼稚兔Igg（最終體積0.65 ml）孵育，在4°C下在0.8ml密封的單酚柱中孵育1小時(shí)。去除未綁定的材料后用0.5 ml冷20mM Tris：鹽酸pH 7.4,150mM氯化鈉，4mM EDTA，0.75%（w/v）Triton X-100洗滌4次。結(jié)合材料用95°C的還原Laemmli樣品緩沖液洗脫。整個(gè)洗脫液裝載在10%丙烯酰胺萊姆利凝膠上。透明的裂解液（50μg蛋白，6μl在20μl還原性Laemmli樣品緩沖液中）平行運(yùn)行。免疫印跡后，樣品在適當(dāng)時(shí)切割后與抗體孵育，在室溫下1小時(shí)為單抗HPC-1抗合成蛋白，或在4°C下過夜為生物素化兔抗Esyt2抗體。Sec22b的檢測是在用于合成蛋白檢測的膜片的低pH剝離后進(jìn)行的，以消除過量的兔免疫球蛋白輕鏈，并與兔抗Sec22b抗體孵育（4°C過夜）。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光和Esyt2與Alexa680偶聯(lián)鏈霉親和素結(jié)合，揭示了Syntaxin和Sec22b的免疫反應(yīng)性。